2023年5月，昆明理工大學譚韜/陳永昌/季維智團隊、中國人民解放軍總醫院劉兵團隊及美國德克薩斯州西南醫學中心吳軍團隊合作，在Cell（IF=66.850）發表題為Ex uteromonkey embryogenesis from blastocyst to early organogenesis的文章。該研究開發了一種嵌入式3D培養系統——EMEUC，實現了食蟹猴胚胎體外發育至25 d.p.f.的長時程培養。結合形態學、組織學和單細胞轉錄組測序分析，系統地解析了原腸運動及造血等早期組織器官發生的譜系特化軌跡和分子演進規律。安諾優達為本研究提供測序服務。

研究背景

在靈長類動物早期胚胎發育過程中，其妊娠第三、四周會經歷關鍵的發育里程碑，最終形成三個主要胚層——外胚層、中胚層和內胚層，并產生各種器官的雛形。在這一時期，發育失敗和畸形可導致早孕流產和出生缺陷。因此，對這個神秘“黑盒子”時期胚胎調控機制的探索，對于提高我們對靈長類胚胎發生的認識和理解早期發育障礙的潛在病因至關重要。

研究者開發了嵌入式3D培養系統——EMEUC，通過優化前期食蟹猴胚胎培養系統，借助細胞外基質構建3D培養環境，最終實現食蟹猴胚胎體外25天長時程培養。其形態、發育進程等與體內胚胎高度一致，約對應體內的CS8c階段。

研究內容

1、單細胞轉錄組揭示EMEUC胚胎特征

通過對EMEUC培養的食蟹猴胚胎（以下簡稱EMEUC胚胎）18 d.p.f.至25 d.p.f.的單細胞轉錄組測序，結合已知譜系的重要Marker基因表達，造血細胞和早期腸細胞兩種類群被發現，主要的25種細胞類型被初步注釋出來。所有細胞可被分為五大類：內胚層、外胚層、滋養層、中胚層和包括軸中胚層（AM）、EPI、神經板、PGCLC、中內胚層（ PS）和軸旁中胚層（ PM）在內的混合細胞群。 混合細胞群中表達祖細胞的Marker，但不表達完全分化細胞類型的Marker?？傊?，單細胞轉錄組測序圖譜描繪了原腸胚形成和早期器官發生階段的食蟹猴體內主要的細胞類型。

圖 EMEUC胚胎的單細胞轉錄組分析

2、EMEUC胚胎的外胚層譜系特化——早期神經外胚層發育

接下來研究者重點關注了EMEUC胚胎早期神經分化情況。首先，經免疫熒光染色進一步驗證了不同時期Marker基因表達特征。其次，經過擬時間分析發現EPI分化為NPPs，隨后分化為NCPLCs和PPLCs，與體內胚胎一致。再次，細胞通訊分析表明了神經譜系分化過程中，NODAL和WNT信號通路被激活。最后，SCENIC分析確定了NPP、 NCPLCs和PPLCs中的轉錄因子（TF）調控和網絡?？傊?，EMEUC胚胎重現了早期神經外胚層發育情況，包括轉錄動力學和空間信號的相互作用。

圖 EMEUC胚胎的早期神經發育

3、EMEUC胚胎的中、內胚層譜系特化和卵黃囊的造血發生

EMEUC胚胎同樣再現了體內胚胎中胚層譜系的表達特征。AM-like和PM細胞群分別與EPI和PS細胞群密切相關，具有缺乏一些中胚層基因的表達，分化程度較低的特征。與之相反，LPM細胞出現了多種成熟細胞類型。

EMEUC胚胎的造血譜系特化高度模擬了體內卵黃囊的兩個波次造血發生，再現了胚胎早期的造血發生。血液中兩個造血祖細胞（cluster14.1 HPC1和cluster14.3 HPC2）依次出現，并具有不同的轉錄組特征。通過和已有文獻小鼠和人類的早期造血scRNA-seq數據集的整合分析，HPC1類似于第一波次造血祖細胞。HPC2與HEC共同出現，與第二波次造血祖細胞密切相關。EMEUC胚胎的HEC比人多能干細胞的HEC更類似于體內胚胎HEC。

除中胚層的譜系特化外，EMEUC胚胎也出現了內胚層的特化，內胚層譜系中的DE細胞（cluster21.1 DE1和cluster21.2 DE2）類似于人增殖DE細胞。EMEUC胚胎鑒定出的前腸后腸亞群與體內猴胚胎和人類胚胎具有高度的一致性。進一步研究表明，BMP和EGF信號通路與前腸形成有關，而WNT和Hedgehog信號通路可能在后腸發育中發揮重要作用。

圖 EMEUC胚胎的中胚層譜系和造血功能

4、EMEUC胚胎內PGCLC細胞的發育和X染色體劑量補償調控

原始生殖細胞樣細胞（PGCLC）同樣會在EMEUC胚胎發生遷移、分化和成熟。EMEUC胚胎內9個不同的PGCLC亞群幾乎貫穿了整個發育階段（18-25 d.p.f.），具有不同的分子特征。在發育過程中，PGCLC細胞開始向卵黃囊遷移，參與氧化磷酸化的基因表達上調，而糖酵解相關基因表達下調，這表明食蟹猴早期生殖細胞發育過程中存在代謝轉換。

通過比較各時期不同性別胚胎內外譜系中X染色體基因表達和X:A的劑量平衡，該研究還系統揭示了食蟹猴早期胚胎發育中的X染色體劑量補償調控過程。雌性PGCLC中X染色體基因表達水平逐漸上調，且存在X染色體再激活過程。參與X染色體失活的 XIST 在雄性早期PGCLCs中很少或沒有表達，晚期升高，而在雌性PGCLC中表達水平相對恒定。

研究結論

該研究開發了一種能夠支持食蟹猴胚胎體外發育至早期器官發生的3D培養體系，成功將食蟹猴體外的胚胎發育延長到早期器官發生階段（~25 d.p.f.），并系統研究了非人靈長類從原腸胚形成到早期器官發生過程的重要細胞組成及譜系分化軌跡，這將有助于了解人類胚胎發育畸形和孕早期流產的病因。